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液相色谱测定食用油黄曲霉毒素含量

[导读]黄曲霉毒素测定方法-高效液相色谱法。

  黄曲霉毒素是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的一组毒性极强的真菌毒素代谢物,黄曲霉毒素B1、B2、G1,和G2 普遍存在于霉变的粮食及粮食制品中,能引起人急性中毒死亡, 与人患肝癌有密切关系。黄曲霉毒素比较耐热,加热至230℃才能被完全破坏,因此一般烹饪加工也不易消除。基于黄曲霉毒素对人体的致毒致癌危害,目前,我国对其在食品中的含量作了严格规定。因此分析测定食品中黄曲霉毒素的含量对保障食品质量安全具有极其重要的意义。黄曲霉毒素测定的方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定法、质谱法及放射免疫测定法等。薄层色谱法曾是检测黄曲霉毒素最早最广的分离技术,但因其操作样品前处理烦琐,并且提取和净化效果不够理想,提取液中杂质较多,目前已很少利用此方法。酶联免疫吸附测定法仅用于平时的快速检测,且假阳性多,因此,目前采用最广泛的方法就是免疫亲和柱-高效液相色谱法。本文采用ACQUITY UPLC H-Class 系统,配合黄曲霉毒素分析包及含大体积流通池的荧光(FLR)检测器,无需衍生化快速测定食品中黄曲霉毒素。ACQUITY UPLC H-CLASS 系统拥有四元溶剂管理器(QSM)和Auto.Blend TM技术,可对溶剂进行动态程序化混合。将水、甲醇和乙腈的三路混合连接ACQUITY UPLC BEH C18 柱完成黄曲霉毒素的分离,消除柱后衍生系统和柱后流量降低造成谱带展宽,形成尖峰,实现高信噪比,以及更精确的积分和定量,使分析时间缩短至5 分钟,最大限度地提高了样品分析的灵敏度和分析速度。

材料与方法

YIQIHESHIJI

  仪器:Waters ACQUITY UPLCHCLASS型超高效液相色谱仪(包括二元溶剂管理器、样品管理器、EMPOWER色谱工作站、含FLR 大体积流通池荧光检测器);HCM0125 黄曲霉毒素总量免疫亲和柱(北京华安麦科生物有限公司);H1850R 低温高速离心机(湖南湘仪公司);0.22 mm 有机滤膜津津腾公司);电动振荡器;AG204 万分之一电子天平。

  试剂:乙腈;甲醇(色谱纯);氯化钠(分析纯);美国赛默飞世尔超纯水机, 电导率(25 ℃) ≤ 0.01ms/m;AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 标准品(1.0 ml/ 瓶,含量为2.0 μg/mL ,编号分别为SB05-195-2008、SB05-196-2008、SB05-197-2008、SB05-198-2008,农业部环境保护科研监测所生产)。

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  标准工作液: 取标准溶液放置室温20 分钟后摇匀,用甲醇稀释AFB1、AFG1 标准溶液使之成为0.100 μg/mL 的标准工作液,用甲醇稀释AFB2、AFG2 标准溶液使之成为0.050 μg/mL的标准工作液,密封避光4℃保存。标准系列溶液: 用35% 甲醇- 乙腈(50+50)- 水逐级将上述标准工作液稀释成混合标准溶液,使成为含AFG10.40 μg/L、1.00 μg/L、2.00μg/L、10.00μg/L、20.0 μg/L;AFB1 0.20μg/L、1.00 μg/L、2.00 μg/L、10.00μg/L、20.00 μg/L;AFG2、AFB2 均为0.050 μg/L、0.20 μg/L、1.00 μg/L、5.00 μg/L、10.00 μg/L 的标准系列溶液,避光保存。

CHAOGAOXIAOYEXIANGSEPUTIAOJIANSEPUZHU

  WATERS ACQUITY UPLC BEH C18(粒径1.7 μm,柱内径× 长为2.1mm×50 mm); 柱温:30 ℃; 室温:20℃;进样量:3.0 μL;荧光检测器, 激发波长:365nm;发射波长:440 nm;流动相由甲醇-乙腈(1:1)35%+ 水65% 组成;流速:0.3mL/min,等度洗脱。

实验方法

▲SHIYANGTIQU

  称取25.00 g 经充分粉碎过的试样于250 mL 碘量瓶中, 加入5.0 g 氯化钠与125 mL 提取液(70% 甲醇-水溶液)混匀;在电动振荡器上振荡20 min 后, 定性滤纸过滤, 收集滤液于100 mL 比色管中, 取10.0 mL 滤液加入20.0 mL 纯净水中,再用微纤维滤纸过滤,并收集滤液;取15.0 mL 滤液过免疫亲和柱净化。

▲YANGPINJINGHUAYUXITUO

  将黄曲霉毒素免疫亲和柱上方塞子取出剪断,再插回亲和柱上;将柱子与气控操作架上的注射器连接固定,准确移取15.0 mL 上述滤液注入,去掉亲和柱下方堵头,调节开关,使液体以约每秒1 ~ 2 滴的流速通过免疫亲和柱;待液体排干后,然后用10.0mL 水淋洗免疫亲和柱2 次, 流速约为每秒1 ~ 2 滴;待液体排干后,准确加入1.0 mL 甲醇将免疫亲和柱吸附的黄曲霉毒素洗脱, 流速约为每秒1 滴,收集全部洗脱液,洗脱液用0.22 μm微孔滤膜过滤后移至进样瓶UPLC 测定。

▲色谱分析

  各取3.0 μL 样品待测液和标准系列溶液注入超高效液相色谱仪,在上述色谱条件下测定,4 种黄曲霉毒素按AFG2 AFG1、AFB2、AFB1 的顺序出峰并能达到基线分离,根据每种黄曲霉毒素的保留时间定性,外标法定量。

结果与讨论

LIUDONGXIANGDEXUANZE

  黄曲霉毒素属于极性化合物, 按GB/T18979-2003 中流动相只由甲醇+水(45+55)组成,甲醇和水各自粘度都很小,当此二者以如此相近比例混合时粘度增大,其粘度差不多是纯甲醇的两倍。此时柱压变化过大且AFG1的灵敏度受影响,由甲醇+ 乙腈与水组成,AFG1 的灵敏度则大大提高。本文最终选定由甲醇+ 乙腈(1:1)35%与65% 水组成流动相。

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  流速过慢,黄曲霉毒素从色谱柱洗脱出来所用的时间比较长,流速过快,则会影响分离度,经实验,最终选择流速为0.3 mL/min 等度洗脱。选择进样量为5.0 μL时,色谱峰形较差且出现平头峰。实验表明,选择流速为0.3 mL/min 等度洗脱,进样量为3.0 μL 时在4.5 分内黄曲霉毒素的峰达到较好分离, 其保留时间分别为:AFG1(2.317 min)、AFB 1 (3.280min)、AFG2 (1.833 min)、AFB2(2.552min)

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  在上述色谱条件下, 分别测定AFB1,AFG1,AFB2 和AFG2 的系列标准溶液,AFB1 标准溶液质量浓度范围为0.20 ~ 20.0 μg/L,AFG2、AFB2 为0.05 ~ 10.00 μg/L,AFG1 为0.40~20.00 μg/L,在上述色谱条件下,相关系数均大于0.999,根据3 倍信噪比的峰响应值, 得出此方法检出限;根据10 倍信噪比的峰响应值, 得出线性范围的下限

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  用本法对浓度值为2.00 μg/L 的标准液重复测试11 次,4 种黄曲霉毒素峰面积相对标准偏差(RSD)<1.5%(n=11)。以本方法测定市售食用植物油样品,并在其中加标进行测试,相当于加入AFB1、AFB2、AFG1、AFG2标准容液浓度分别为:2.00 ng/mL、1.00ng/mL、2.00 ng/mL、1.00 ng/mL, 其加标回收率分别为:105%、101%、103%、101%,加标回收率符合相关标准要求。




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