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津腾隔膜泵应用于ICOS转基因小鼠感染日本血吸虫研究

[导读]​观察ICOS转基因小鼠感染日本血吸虫后原代肝星状细胞(HSCs)的活化效应,探讨ICOSL/ICOS信号介导HSCs活化在血吸虫病肝纤维化形成中的作用。方法 建立ICOS-Tg小鼠及野生型小鼠日本血吸虫模型,通过肝脏酶灌注法和密度梯度离心法分离感染前

观察ICOS转基因小鼠感染日本血吸虫后原代肝星状细胞(HSCs)的活化效应,探讨ICOSL/ICOS信号介导HSCs活化在血吸虫病肝纤维化形成中的作用。方法 建立ICOS-Tg小鼠及野生型小鼠日本血吸虫模型,通过肝脏酶灌注法和密度梯度离心法分离感染前(0周)和感染后(4~9周)的小鼠原代HSCs,运用台盼蓝拒染法鉴定分离的原代HSCs成活率;应用其在328nm波长紫外激发光下自发荧光特性以及在肝细胞中其特异性表达神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)鉴定分离的原代HSCs纯度;培养7d后,采用SYBR染料法实时荧光定量PCR检测原代HSCs中TGF-β1,Ⅰ、Ⅲ型胶原及α-SMA mRNA的表达变化。结果 分离的原代HSCs纯度达到90%,其成活率为95%。ICOS-Tg小鼠肝HSCs中α-SMAmRNA表达水平即HSCs的活化程度在感染后6、9周显著高于同时期野生型小鼠(P<0.01)。ICOS-Tg小鼠肝HSCs中TGF-β1,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA水平亦高于同时期野生型小鼠的水平,特别是在感染后6、9周呈显差异有统计学意义(P<0.01~0.05)。结论 与野生型小鼠相比,感染日本血吸虫的ICOS-Tg小鼠肝HSCs活化增强,显著上调TGF-β1mRNA、Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA及α-SMA mRNA的表达,提示在ICOS-Tg小鼠,ICOSL/ICOS信号的增强可明显上调HSCs活化促进肝纤维化的形成。

声音好听的女生兼职 GUANJIANCI:RIBENXUEXICHONG;ICOSZHUANJIYINXIAOSHU;GANXINGZHUANGXIBAO;TGF-β1;GANXIANWEIHUA

血吸虫病是以虫卵诱发宿主肉芽肿反应及继发纤维化为特征的免疫病理性疾病。血吸虫病肝纤维化是一个机体纤维成和基质降解失衡的动态变化过程,可导致门静脉高压、肝硬化、腹水等并发症[1-2]。HSCs的活化已被认为是肝纤维化发展过程中的重要环节,其活化、增殖以致发生表型和功能的改变,转化为肌成纤维细胞,并大量合成以Ⅰ型、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix,ECM),超过了机体的降解能力,使ECM 在肝内过量沉积导致纤维化形成[3-4]。课题组前期研究已表明,ICOSL/ICOS信号介导的Th2极化与感染日本血吸虫导致的肝纤维化有关[5-6]。在此基础上,本实验通过观察ICOS-Tg小鼠原代HSCs活化及其对肝纤维化形成的影响,进一步探讨ICOSL/ICOS信号在血吸虫病肝纤维化中的作用制。

1 CAILIAOYUFANGFA

1.1 CAILIAO

1.1.1 实验动物 由扬州大学比较医学中心提供遗产背景品系为FVB/NJ的ICOS-Tg小鼠,所有实

验小鼠均置于苏州大学实验动物中心SPF实验动物大楼中饲养,采用自动温度控制(22±1)℃,自动光控(12h明/12h暗),自由进食及饮用洁净水。日本血吸虫尾蚴阳性钉螺购自江苏省血吸虫病防治研究所。

1.1.2 试剂 Collagenase TypeⅠ(Gibco)、PronaseE(Roche)、DNaseⅠ(Sigma)、Optiprep细胞分离液(Axis-shield)、RPMI-1640培养基和低糖DMEM 培养基(Hyclone)、胎牛血清(Gibco)、Triton X-100(Amresco)、Hepes和EGTA(Solarbio)、GFAP抗体和SABC-CY3(武汉博士德)、Trizol(Invitrogen)、DEPC水(上海生工生物)、Prime-Script TMRT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)、TGF-β1,Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA mRNA和内参基因β-actin mRNA(华大基因)等。

1.1.3 主要仪器 津腾容剂过滤器和津腾隔膜真空泵GM-0.33A(天津津腾实验设备有限公司);BT-100型蠕动(恒流)泵YZ9901(上海青浦沪西仪器厂);恒温混匀仪TZL-200(苏州帕西瓦尔实验设备有限公司);Olympus CX31显微镜(日本Olympus);Olympus C-7070照相机(日本Olympus);Eppendorf PCR扩增仪(德国Eppendorf公司);StepOne Plus Real-Time PCR Systerm (美国ABI);活细胞工作站(德国Leia);倒置相差显微镜(日本Olympus);Nanodrop 2000超微量分光光度计(美国Thermo)。

1.1.4 主要试剂 灌注液Ⅰ:氯化钠8.0g,氯化钾0.402g,二水磷酸二氢钠0.093 6g,十二水磷酸氢二钠0.286 5g,HEPES 2.383g,EGTA 0.190g,碳酸氢钠0.352 8g,葡萄糖0.901g,pH7.2~7.4。灌注液Ⅱ:0.04% CollagenaseⅠ,加RPMI-1640至100mL,pH7.2~7.4。振荡消化液:0.08% CollagenaseⅠ,0.08% Pronase E,5U/mL DNaseⅠ,加RPMI-1640至100mL,pH7.2~7.4。所有溶液均

需0.22μm过滤除菌,并且在37℃培养箱中预热后使用。

声音好听的女生兼职 1.2 FANGFA

1.2.1 实验动物模型的建立 将钉螺置于洁净的去氯水中,25℃,光照下逸出日本血吸虫尾蚴,每只小鼠经腹部皮肤感染15±1条尾蚴,实验小鼠均在SPF级动物房饲养。

1.2.2 HSCs的分离 腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠,待小鼠麻醉后,将其浸泡于75%酒精15s,将其固定于解剖台上,打开腹腔,暴露肝门静脉,从门静脉插管,灌注灌注液Ⅰ,同时剪短下腔静脉,待肝脏变成土黄色后,更换灌注液Ⅱ进行灌注5~7min,将肝脏游离至事先加入5mL RPMI-1640培养基的平皿中;继续灌注,直至肝脏呈糜烂状后停止灌注,撕除肝包膜,尽量撕碎肝组织,去除结缔组织,将肝组织倒入装有20mL振荡消化液的50mL离心管中,37℃振荡消化20~30min;终止消化,200目尼龙筛网过滤,收集细胞悬液,400r/min×6min,取上清;2 000r/min×6min,弃上清,5mL RPMI-1640洗涤两次,之后加入1.5mL RPMI-1640重新悬浮细胞,待用;于50mL离心管中分别缓慢加入4mL 16%梯度分离液、4mL 12%梯度分离液,最后小心加入上述细胞悬液;离心,4 000r/min×20min;吸取目的层细胞,加入RPMI-1640离心洗涤2次后重悬计数。

1.2.3 HSCs的培养 RPMI-1640重悬细胞后,然后以1×106个细胞接种于25cm2透气培养瓶中,含15%低糖DMEM 完全培养基,37℃,5%CO2培养箱培养。24h后第1次换液,以后每48h换培养液1次。


1.2.4 FENLIXIBAODEJIANDING

1.2.4.1 台盼蓝计数 将适量洗涤好的细胞悬液用台盼蓝染色后,置于显微镜下观察计数,计算细胞的成活率。

1.2.4.2 小鼠原代HSCs自发荧光检测 将分离出的新鲜小鼠HSCs置于培养皿中,应用倒置荧光显微镜相差模式观察其细胞形态,并在波长为328nm的紫外激发光下观察细胞蓝绿色自发荧光。

1.2.4.3 神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学实验 将培养5d的HSCs用兔抗小鼠GFAP(Glial fibrillary acidic protein)一抗、生物素化羊抗兔IgG 二抗和SABC-Cy3进行免疫荧光染色,检测GFAP表达,计算细胞的纯度。

1.2.4.4 原代HSCs总RNA 抽提及cDNA 的合成 将小鼠不同病期原代HSCs以1×106个/mL的密度接种于6孔细胞培养板中,15%低糖DMEM完全培养基,37℃,5%CO2培养箱培养7d后收集

细胞。细胞总RNA 的抽提:参照MIQE法则确保实时荧光定量PCR检测结果的准确[7]。将原代培养7dHSCs培养瓶中的培养基倒净,用预冷的PBS5mL洗涤3min,2次,加入1mL预冷的TRIzol试剂,室温静置10min,充分吹打至无明显细胞团块,使细胞充分裂解;将细胞裂解液转入灭菌的无Rnase的带盖1.5mL Ep管中,室温静置15min;加入200μL的氯仿,剧烈振荡30s后,室温静置5~10min。4℃、12 000r/min离心15min,使Ep管中液体分为3层,上层为含RNA 水相,中间为DNA,下层为含蛋白质的有机相,转移上层水相至另一个新的灭菌无Rnase的带盖1.5mL Ep管中,加入等体积的异丙醇,上下颠倒充分混匀,室温静置10min。4℃、12 000r/min离心15min。弃上清,


沉淀中加入1mL -20℃预冷的75%酒精(DEPC水配制)洗涤除盐,振荡30s,4℃、7 000r/min离心5min,2次。小心弃上清,再离心数秒,用灭菌无Rnase的枪头吸去多余液体,空气干燥10min,用20μL DEPC水溶解RNA沉淀。所有RNA样品在Nanodrop 2000 超微量分光光度计下测定其OD260/OD280的比值,范围在1.8~2.0,以保证待测RNA浓度、纯度及完整性。



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